Enzymer er biologiske katalysatorer. De senker aktiveringsenergien, slik at peptidbindingene spaltes raskt ved kroppstemperatur. Enzymet blir ikke brukt opp.

Spalting av peptider er en hydrolyse. Et vannmolekyl reagerer med peptidbindingen, og bindingen mellom C og N brytes. OH fra vannet bindes til karbonylkarbonet, og H bindes til N-atomet:

Hydrolysen er den omvendte reaksjonen av kondensasjonen som danner peptidbindingen.

Karboksylgruppen i alanin reagerer med aminogruppen i treonin. Ett vannmolekyl spaltes av, og det dannes en peptidbinding. Dipeptidet er Ala–Thr:

Et karbonatom er kiralt når det har fire ulike grupper bundet til seg. Dipeptidet har tre kirale C-atomer:

• α-karbonet i alanin: H, $\mathrm{C}{\mathrm{H}}_3$, $\mathrm{N}{\mathrm{H}}_2$ og resten av peptidet.
• α-karbonet i treonin: H, $\mathrm{COOH}$, $\mathrm{NH}$ i peptidbindingen og sidekjeden.
• Karbonatomet med OH-gruppen i treonin: H, OH, $\mathrm{C}{\mathrm{H}}_3$ og resten av peptidet.

De andre C-atomene er $\mathrm{C}{\mathrm{H}}_3$-grupper eller karbonylkarbon, og de er ikke kirale.

Rekkefølgen Thr–Ala er også riktig. Den har også tre kirale C-atomer. Dipeptidet kan også tegnes som zwitterion.

Reaksjonslikningen viser at 1 mol alanin reagerer med 1 mol metanol og gir 1 mol ester.

Metanol er i stort overskudd, så alanin er begrensende reaktant. Teoretisk kan det dannes $\mathrm{0,1000}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}$ ester:

Vannet i papiret er den stasjonære fasen, og den er polar. Løpemiddelet er for det meste propanol og er mindre polart. En polar eller ladd aminosyre bindes sterkt til vannet i papiret og vandrer kort. En mindre polar aminosyre løser seg bedre i løpemiddelet og vandrer lenger.

Alle tre har amino- og karboksylgruppe på α-karbonet. Forskjellen ligger i sidekjeden:

• Glutaminsyre har sidekjeden $\text{–}\mathrm{C}{\mathrm{H}}_2\text{–}\mathrm{C}{\mathrm{H}}_2\text{–}\mathrm{C}\mathrm{O}\mathrm{O}\mathrm{H}$. Glutaminsyre har altså to polare COOH-grupper. De gir flere hydrogenbindinger til den polare stasjonære fasen. Glutaminsyre vandrer kortest og er aminosyre 1.
• Serin har sidekjeden $\text{–}\mathrm{C}{\mathrm{H}}_2\text{–}\mathrm{O}\mathrm{H}$. OH-gruppen er polar og danner hydrogenbindinger. Serin er aminosyre 2.
• Leucin har den upolare sidekjeden $\text{–}\mathrm{C}{\mathrm{H}}_2\text{–}\mathrm{C}\mathrm{H}{(\mathrm{C}{\mathrm{H}}_3)}_2$. Leucin løser seg best i løpemiddelet, vandrer lengst og er aminosyre 3.

Glutaminsyre og serin har ganske lik polaritet, så flekkene deres ligger nær hverandre.

Zwitterionet $\mathrm{C}{\mathrm{H}}_3\text{–}\mathrm{C}\mathrm{H}(\mathrm{N}{\mathrm{H}}_3^{+})\text{–}\mathrm{C}\mathrm{O}{\mathrm{O}}^{-}$ har tre grupper av ekvivalente H-atomer. Spekteret får derfor tre signaler. Splittingen følger $n+1$-regelen.

• $\mathrm{C}{\mathrm{H}}_3$ (3 H): Nabokarbonet har 1 H, så signalet blir en dublett. Skiftet er ca. 1,5 ppm. Det er litt høyere enn 0,9–1,0 ppm i vedlegget, fordi nabokarbonet er bundet til $\mathrm{N}{\mathrm{H}}_3^{+}$ og $\mathrm{C}\mathrm{O}{\mathrm{O}}^{-}$.
• $\mathrm{CH}$ (1 H): Nabokarbonet har 3 H, så signalet blir en kvartett. H på N gir ikke splitting. C-atomet er bundet til både $\mathrm{N}{\mathrm{H}}_3^{+}$ og $\mathrm{C}\mathrm{O}{\mathrm{O}}^{-}$, som trekker elektroner. Det gir høyt skift, ca. 3,8 ppm.
• $\mathrm{N}{\mathrm{H}}_3^{+}$ (3 H): Ingen splitting, så signalet blir en singlett. Den positive ladningen på N gir lite skjerming og høyt skift, ca. 8 ppm.

De relative arealene er $\mathrm{C}{\mathrm{H}}_3:\mathrm{CH}:\mathrm{N}{\mathrm{H}}_3^{+}=3:1:3$.

Løst i ${\mathrm{D}}_2\mathrm{O}$ byttes H på N ut med D, og $\mathrm{N}{\mathrm{H}}_3^{+}$-signalet forsvinner. Oppgaven ber om å ta med H på N, så signalet er med i skissen.